產品及特點

細小病毒感染是嚙齒類實驗動物常見的病原體感染之一。小鼠細小病毒(Mouse Parvovirus，MPV)曾在小鼠中被分離得到。MPV是鼠脾細胞培養物潛在的污染物。細小病毒感染小鼠，通常無癥狀臨床表現，但研究表明，在涉及免疫系統、腫瘤和移植的實驗中，體內、外感染MPV將會嚴重影響實驗數據的準確性和可信性。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測小鼠細小病毒（MPV）的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據小鼠細小病毒DNA高度保守區設計，不會跟其他的DNA發生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6.本產品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR反應。

7.本產品只能用于科研。

一、稀釋標準曲線樣品（以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同。

3.在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備 7.如果有 N 個樣品好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10 μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的提取試劑。

三、Probe qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

四、數據處理

12.如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要重新樣本制備，重新進行PCR擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于40，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于40，則為陰性。如果Ct小于40則為陽性。