纖維素酶的分離純化-纖維素酶的發酵

纖維素酶來源廣泛、組分復雜，各組分的相對分子質和等電點相差很小，分離純化工作比較困難；而纖維素酶的分離純化工作非常重要，只有得到純酶才能了解其組成、性質及相互關系，并可根據纖維素酶的不同理化性質及纖維材料的作用持點，開展纖維素降解機制的研究，為纖維素酶分子結構研究、酶基因克隆、新酶分子的構建和DNA體外定點誘變等提供依據，下面介紹纖維素晦分離純化的般流程。

、粗酶液制備

固態發酵：用定量水浸泡固態發酵基質，后壓滋得到液休醇制劑，再在4℃條件下離心，取上清液，即為粗醇液，測定粗酶液中纖維素的酶活力和蛋白質含量。

液態深層發酵：取發酵液于4℃，8000r/min，離心15min，收集上清液即為粗酶液，測定粗酶液中纖維素的酶活力和蛋白質含量。

二、粗酶液硫酸銨分沉淀

準確取定體積的粗酶液，在冰水浴（0℃）和磁力攪拌器勻速攪拌條件下，緩慢添加經干燥和研磨的硫酸銨粉末至粗酶液中，使酶液中硫酸皺的飽和度分別達10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，在冰水浴中緩慢攪拌充分混合30min后，離心收集沉淀用定量緩沖液溶解后，按照DNS法測定纖維素晦活力以及沉淀中的蛋白質總量，以此來確定去除雜蛋白所需的飽和硫酸銨的濃度。同時也可用少量上清液測定酶活力及蛋白質總量。

準確取定體積的上清液，重復以上操作至45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%和90%硫酸皺飽和度（假設去除雜蛋白的飽和硫酸皺濃度為30%），在冰水浴中緩慢攪拌，攪拌過程中應盡量避免泛起白色泡沫.30min后，4℃、10000r/min條件下離心10min，取少量上清液測定酶活力和蛋白質濃度；收集沉淀，加入少量緩沖液溶解，再分別測定纖維素酶酶活力和蛋白質含量，然后根據下面的公式分別計算出不同硫酸銨濃度所得的比活力、純化倍數和回收率（得率）。

比活力=活力蛋白數/蛋白質含量（毫克）純化倍數每步的比活力/粗酶液的比活力

得率=每步的總活力/粗晦液的總活力

由此，可得佳的沉淀纖維素酶的飽和硫酸銨的濃度。

三、透析除鹽

1.透析袋預處職

商品透析袋（截流根據纖維素酶的相對分子質量確定）常常涂甘油以防破裂，并含有微量的硫化物、重金屬和些雜環類物質，它們容易引起蛋白質變性，因此用前需除去。其方法如下。

0①將透析管剪成適當長度（10~20cm）的小段，即形成透析袋。

②在大體積的2%的和1mmol/LEDTA（pH8.O）中將透析袋煮沸10min。

③將透析袋用蒸餾水漂洗。

④將透析袋置于1mmol/LEDTA（pH8.0）中煮沸10min。

⑤待透析袋冷卻，存放于4℃，應確保透析袋始終浸沒在液體中。

⑥在使用之前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。

2.透析法除去硫酸侯

將已處理好的透析袋用細線扎緊底端，然后將用佳他和硫酸銨濃度沉淀的粗酶液從管口倒入袋內，注意不能裝滿，留半左右的空間，以防膜外溶劑大量進人袋內將袋脹破，或因透析袋膨脹引起膜孔徑大小的改變，裝入粗酶液后，扎緊袋口，懸浮于裝有大量pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中，盛緩沖液的燒杯置于磁力攪拌器上，4℃透析24h。注意勤換緩沖液，般3~4次即可收集造析液。

四、分子篩柱層析

選擇不同的葡聚糖凝膠（常見的有SephadexG-100、SephadexG-75、SephadexG-50，可根據具體情況各做次，比較優劣），充分溶賬，抽氣，分別裝柱。不同的層析柱體積不同，因此所需的凝膠量也不相同，需要根據柱體積以及所選的凝膠的溶脹度進行計算，然后用定濃度和pH的磷酸緩沖液充分平衡后上樣，選擇合適的流速、檢驗器靈敏度，測定出現吸收峰時各管的纖維素酶活力及蛋白質含。

具體的凝膠的預處理、裝柱、平衡、上樣、洗脫及收集方法，以及各個過程的注意事項可參考相應的說明書及相關參考書完成，此處不再贅述。

五、SDS-PAGE凝膠電泳

采用SDSPAGE凝膠電泳鑒定所分高的蛋白質的純度，并對其相對分子質進行測定。

般多使用垂直板式不連續系統電泳，分高膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%，利用相應的標準蛋白相對分子質量標準品，電泳后用0.25%的考馬斯亮藍R-250酸性乙醇水染色，先后用高倍與低倍甲醇脫色液充分脫色。用直尺分別量出標準蛋白、待測蛋白質區帶距分離膠頂端的距離，根據標準蛋白marker的遷移率所作的回歸方程，確定目標蛋白的相對分子質量。

再根據蛋白在凝膠上的條帶的多少以及粗細來確定所分離蛋白的纖維素酶的純度。

●思考題

1.簡述纖維素酶降解纖維的作用機理。

2.參考相關材料設計篩選產纖維素酶的細菌、放線菌的實驗方案。

3.比較纖維素酶發酵生產的兩種方法的優缺點，

4.纖維素酶經硫酸銨沉淀后需要除鹽，除透析法之外還有什么方法？