菌種的原生質體融合育種方法

要使發酵工業產品的種類、產量和質量有較大的改善，先必須選取性能優良的生產菌種。菌種選育包括根據菌種的自然變異而進行的自然選育，以及根據遺傳學基礎理論和方法利用誘變育種技術、原生質體融合技術、基因工程技術而進行的誘變育種、細胞工程育種、基因工程育種等。

細胞壁被酶解剝離，剩下的由原生質膜包圍的原生質部分稱為原生質體。原生質體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體發生融合，并產生全重組子的過程。原生質體融合技術是繼轉化、轉導和接合等微生物基因重組方式之后，又個其重要的基因重組技術。原生質體融合技術的運用，使細胞間基因重組的頻率大大提高，基因重組親本的選擇范圍也得以擴大，可以在不同種、屬、科，甚至更遠緣的微生物之間進行。這為利用基因重組技術培育更多更優良的生產菌種提供了可能。原生質體融合技術已廣泛應用于細菌、放線菌、霉菌和酵母菌的育種。

微生物原生質體融合分為以下五大步驟：

1.選擇親株

為了能明確檢測到融合后產生的重組子并計算重組頻率，參與融合的親株般都需要帶有可以識別的遺傳標記。常用營養缺陷型或抗藥性作為標記，也可以采用熱致死、孢子顏色、菌落形態等作為標記。在進行原生質體融合前，應先測定菌株各遺傳標記的穩定性，如果自發回復突變的頻率過高，則不宜采用。

2.原生質體制備

為了制備原生質體，去除細胞壁是關鍵。去壁的方法有三種：機械法、非酶分離法和酶解法。般都采用酶解法去壁，根據微生物細胞壁組成和結構的不同，需分別采用不同的酶，如、纖維素酶、蝸牛酶等。

放線菌肽聚糖革蘭氏陰性菌肽聚糖和脂多糖和EDTA霉菌纖維素和幾丁質纖維素酶或真菌中分離的溶壁酶酵母菌葡聚糖和幾丁質蝸牛酶

在菌體生長的培養基中添加，可以使菌體較容易被酶解，滲入細胞壁肽聚糖中代替D的位置，影響細胞壁中各組分間的交聯度。在菌體生長階段添加蔗糖，擾亂菌體的代謝，也能提高細胞壁對的敏感性。因為能干擾肽聚糖合成中的轉肽作用，使多糖部分不能交聯，從而影響肽聚糖的網狀結構的形成，所以，在菌體生長對數期加入適量，能使細胞對更敏感。

3.原生質體融合

聚乙二醇（pEG）能有效地促進原生質體融合。其助融作用可能與下列過程有關：開始時，由于強烈的脫水而使原生質體粘在起，并形成聚合體。原生質體收縮并高度變形，使原生質體之間的接觸面增大。細胞膜結構發生紊亂，加大了細胞膜的流動性，膜內的蛋白質和糖蛋白相互作用和混合，使緊密接觸的原生質體相互融合。pEG對細胞尤其是原生質體也有定的毒害作用，因此，作用的時間般不宜過長。pEG有不同的聚合度。在細菌原生質體融合中，多采用高相對分子質量的pEG（如pEG6000）；對放線菌則可采用各種相對分子質量的pEG。pEG的使用濃度范圍般在30%~50%，但隨著微生物種類的不同而異。此外，物理融合劑，如電場和激光也能有效促進融合。

4.融合體再生

融合體再生就是使原生質體融合體重新長出細胞壁，恢復完整的細胞形態結構。能再生細胞壁的原生質體只占總量的部分。細菌般再生率為3%~10%；真菌再生率般在20%~80%；鏈霉菌再生率高可達50%。若要獲得較高的再生率，在實驗過程中應避免因強力動作而使原生質體破裂。在將原生質體懸液涂布在再生培養基平板上前，宜預先去除培養基表面的冷凝水。涂布時，原生質體懸液的濃度不宜過高。因為若有殘存的菌體存在，它們將會在再生培養基中長成菌落，并抑制周圍原生質體的再生。另外，菌齡、再生時的溫度、用量和溶壁時間等因素都會影響原生質體融合體的再生。

5.篩選優良性狀融合重組子

重組子的檢出方法有三種：直接法、間接法和鈍化選擇法。直接法是將融合液涂布在不補充親株生長需要的生長因子的高滲再生培養基平板上，直接篩選出原養型重組子。間接法是把融合液涂布在營養豐富的高滲再生平板上，使親株和重組子都再生成菌落，然后用影印法將它們復制到選擇培養基上，檢出重組子。鈍化選擇法是在融合前使親本中的方（野生型）原生質體代謝途徑中的某些酶鈍化不能再生，再與另方（雙缺陷型）原生質體融合，融合體在基本培養基上分離。

以上獲得的還僅僅是融合重組子，尚需進行生理生化測定及生產性能的測定，以確定是否符合育種的要求。