生產的種子制備

內發酵的種子擴大培養普遍采用二種子擴大培養，流程如下：斜面菌種種子二種子發酵罐菌種的斜面培養必須有利于菌種生長而不產酸，并要求斜面菌種無雜菌和噬菌體污染。培養條件應有利于菌種繁殖。培養基多含有機氮，不含或少含糖。

斜面培養基組成為：葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，NaCl0.5%，瓊脂2.0%~2.5%，ph 7.0~7.2（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）。7338、B9類菌種培養溫度為30~32℃，T613類菌種培養溫度為33~34C，培養18~24h。

每批斜面菌種培養完成后，觀察菌種生長，顏色和邊緣等特征是否正常，有無感染雜菌和噬菌體的征兆，質量有問題的菌種不用于生產，同時查明污染的原因。斜面菌種的培養是生產過程中的重要環節，操作必須嚴格認真，無菌室的環境和設施要達到無菌控制的要求，同時加強管理，經常打掃和滅菌，防止雜菌和噬菌體的污染。

生產中使用的斜面菌種不宜多次移接，般移接三代，以免菌種衰退。在生產中經常進行菌種的分離純化，不斷提供新的斜面菌株滿足生產的需求。

種子培養的目的在于獲得大量繁殖活力強的菌體。為達到此目的，培養基組成應以少含糖分，多含有機氮為主，培養條件有利于菌種快速地增殖。培養基組成為：葡萄糖2.0%，尿素0.5%，MgSO40.04%，K2hpO40.1%，玉米漿2.5%~3.5%，FesO40.0002%，MnSO40.0002%，ph7.0（菌種不同，培養基成分可以適當調整）。

培養條件為：1000mL三角瓶裝入培養基200mL，100r-min-1，振蕩培養12h，7338和B9類菌的培養溫度為30~32℃，T613類菌為33~34℃。

種子質量要求為：種齡12h，ph6.4，無噬菌體污染，菌體生長均勻、粗壯、排列整齊，OD值凈增0.5以上，殘糖0.5%以下，無雜菌污染，革蘭氏反應為陽性。

某些工廠為了防止感染雜菌和噬菌體，種子先做平板檢驗，確認無雜菌及噬菌體感染后接入二種有的工廠種子不用三角瓶搖瓶培養，而是培養大型斜面（茄子瓶斜面）作為種子使用。次制備批種子，貯存于冰箱中。這種做法的優點是利用固體培養物比液體培養物容易保存的優點，次制備批大型斜面，不用重復制備種子。

為了獲得發酵所需要的足夠數量的菌體，進行種子罐的二種子培養。二種子的培養基，因菌種不同而有較大差異。T613的菌種二擴大培養基組成為：葡萄糖3%，玉米漿2.5%，Kh2pO40.15%，MgSO40.04%，尿素0.4%，Mn2+0.0001%，Fe2+0.0001%。種子罐體積取決于發酵罐的體積和接種比例。

在實際生產中，應根據菌體生長情況，調整培養基組成。培養條件為：接種量0.8%~1.0%；培養溫度為30~32℃（不同菌種溫度不同）；不同容量的種子罐通風量有所不同，如50L種子罐通氣量1：0.5m3-（m3-min）-1，攪拌轉速為340r-min-1，500L種子罐通風量為1：0.25m3（m3-min）-1，攪拌轉速為230r-min-1。二種子質量要求為：種齡7~8h，無噬菌體和雜菌污染，ph7.2，OD值凈增0.5，殘糖消耗1%左右，菌種生長旺盛，排列整齊，革蘭氏染色為陽性。

影響種子質量的因素共有六項：

①種子培養基要含有充足的氮源和維生素、少量的碳源，以利于菌體生長，如果糖分過多，有機酸使ph降低，菌種容易衰老；

②幼齡菌對溫度變化敏感，應避免溫度急劇變化；

③開始培養時ph不宜過高，培養結束時ph不宜過低；

④菌體生長的適溶解氧濃度并不是特別高；

⑤接種量低，菌體增長緩慢，延滯期長，培養時間長影響種子活力，接種量過大，操作中易引起污染，般接種量以1%左右為宜；

⑥培養時間不宜太長，般7~8h，對數期菌種接入發酵罐。