自然界工業(yè)菌種分離篩選程序

良好的落種是微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)，在應(yīng)用微生物生產(chǎn)各類(lèi)食品時(shí)，先遇到的是選種的問(wèn)題。要挑選出符合需要的菌種，方面可以根據(jù)有關(guān)信息向菌種保藏機(jī)構(gòu)、工廠或科研單位直接索取，另方面可根據(jù)所需菌種的形態(tài)、生理、生態(tài)和工藝特點(diǎn)的要求，從自然界特定的生態(tài)環(huán)境中以特定的方法分離出新菌株。其次是育種的工作，根據(jù)菌種的遺傳特點(diǎn)，改良菌株的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量不斷提高。三，當(dāng)菌種的性能下降時(shí)，要設(shè)法使它復(fù)壯。后，還要有合適的工藝條件和合理、的設(shè)備與之配合，這樣菌種的優(yōu)良性能才能充分發(fā)揮。

自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離篩透、生產(chǎn)性能測(cè)定等。如果產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還需對(duì)菌種進(jìn)行毒性鑒定。

（1）采樣

菌種的采樣以采集土壤為主。般在有機(jī)質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量多，中性偏堿的土壤以細(xì)菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，采園、菜園和野果生長(zhǎng)區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，采樣的對(duì)象也可以是植物、物品，某些水域等。采樣應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，以溫度適中、雨量不多的初秋為好，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活數(shù)量較少，暴雨后上壤中微生物會(huì)顯著減少。采樣方式是在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用無(wú)菌刮鏟、土樣采集器等采集有代表性的樣品，如特定的土樣類(lèi)型和土層，葉子碎屑和底殖質(zhì)，根系及根系周固區(qū)域，海底水、泥及沉積物，植物表皮及各部分，陰溝污水及污泥，反芻動(dòng)物胃內(nèi)含物，發(fā)酵食品等。

具體采集土樣時(shí)，就森林、早地、草地而言，可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，般是在不損壞土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面5~15cm處的土，將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中，采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類(lèi)及采集日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等。采好的樣品應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)儲(chǔ)存于4℃下，但儲(chǔ)存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。這是因?yàn)榈┎蓸咏Y(jié)束，樣品中的微生物群體就脫離了原來(lái)的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng)，如果要分離嗜冷菌，則在室溫下保存樣品會(huì)使嗜冷菌數(shù)量明顯降低。

在采集植物根際土樣時(shí)，般方法是將植物根從土壤中慢慢撥出，浸潰在大量無(wú)菌水中約20min，洗去黏附在根上的土壤，然后用無(wú)菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。

在采集水樣時(shí)，將水樣收集于100ml干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，應(yīng)從較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶浸入水中30~50cm處，瓶口朝下打開(kāi)瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話(huà)，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。水樣采集完畢時(shí)，應(yīng)迅速?gòu)乃腥〕霾杉坎в休^大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿(mǎn)采樣瓶，采集的水樣應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測(cè)，或者于4℃下儲(chǔ)存。

（2）增殖培養(yǎng)

般情況下，采來(lái)的樣品可以直接進(jìn)行分離，但有時(shí)樣品中所需要的菌類(lèi)含量并不是很多，而另些微生物卻大量存在。此時(shí)，為了容易分離到所需要的菌種，讓無(wú)關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所需要菌種的數(shù)量以增加分離的概率，可以通過(guò)選擇性的配制培養(yǎng)基（如添加營(yíng)養(yǎng)成分、抑制劑等），選擇定的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等）來(lái)控制。具體方法是根據(jù)微生物利用碳源的特點(diǎn)，可選定糖、淀粉、纖維素或者石油等，以其中的種為碳源，那么只有利用這碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其他微生物就可能死亡或被淘汰。對(duì)革蘭氏陰性菌有選擇的培養(yǎng)基（如結(jié)晶紫營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、紅紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等）通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細(xì)菌時(shí)，向培養(yǎng)基中添加濃度般為50ug/mL的抗真菌制劑（如放線藍(lán)酮和），可以抑制真菌的生長(zhǎng)。在分離放線菌時(shí)，通常向培養(yǎng)基中加入1~5mL天然浸出汁（植物、巖石、有機(jī)混合腐殖質(zhì)等的浸出汁）作為初分離的促進(jìn)因子，由此可以分離出更多不同類(lèi)型的放線菌。放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復(fù)雜底物（如幾丁質(zhì)），因此，大多數(shù)放線藍(lán)的分離培養(yǎng)是在貧瘠或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的，而不是在含豐富營(yíng)養(yǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上分離的。此外，為了對(duì)某些特殊類(lèi)型的放線菌進(jìn)行富集和分離，可選擇性地添加些抗生素（如新生霉素）。在分離真菌時(shí)，利用低碳氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散，利于計(jì)數(shù)、分離和鑒定。在分離培養(yǎng)基中加入定的抗生素如、四環(huán)素、、、等即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及其菌落形成。抑制細(xì)菌的另外些方法有：在使用培養(yǎng)皿之前，將培養(yǎng)皿先干燥3~4d；降低培養(yǎng)基的pH，或在無(wú)法降低pH時(shí)加入1：30000玫瑰紅。抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，有利于下階段的純種分離，

（3）培養(yǎng)分離

通過(guò)增殖培養(yǎng)，樣品中的微生物還是處于混雜生長(zhǎng)狀態(tài)，因此必須進(jìn)行分離、純化。

在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)步應(yīng)用，而且要控制得細(xì)點(diǎn)，好點(diǎn)，同時(shí)必須進(jìn)行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)缓髮⑾♂屢和坎加谂囵B(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)出立的單個(gè)菌落，進(jìn)行挑選分離。劃線分離法要先倒培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或次劃線法，無(wú)論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個(gè)菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原藍(lán)的分離。分離時(shí)，先用10%漂白粉或0.1%液對(duì)植物或器官組織進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水洗滌數(shù)次后，移植到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見(jiàn)數(shù)生物向組織塊周?chē)鷶U(kuò)展生長(zhǎng)。經(jīng)觀察確認(rèn)菌落特征和細(xì)胞特征后，即可由菌烙邊緣挑取部分菌種進(jìn)行移接斜面培養(yǎng)。

對(duì)于有些薇生物如毛霉、根需等在分離時(shí)，由于其就絲的蔓延性，易生長(zhǎng)成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離，

（4）篩選

經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)，在平板上出現(xiàn)很多單個(gè)菌落，通過(guò)菌落形態(tài)觀察，選出所需菌落，然后取菌落的半進(jìn)行菌種鑒定，對(duì)于符合目的菌特性的菌落，可將之轉(zhuǎn)移到試管斜面純培養(yǎng)。這種從自然界中分離得到的純種稱(chēng)為野生型菌株，它只是篩選的步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實(shí)用價(jià)值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過(guò)用三角瓶進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)得到適合于工業(yè)生產(chǎn)用的菌種，如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌襪。