光學顯微鏡經過了我們偉大的前人們的努力與改良,已經臻于*的地步。事實上,通常的顯微鏡可以簡單、快捷地為我們提供美麗的微觀圖像。但是,給這個近乎*的顯微鏡世界帶來革命性創新的事件發生了,這就是“激光掃描型共聚焦顯微鏡”的發明。這種新型顯微鏡的特點是:采用僅將焦點所集中的面上的圖像情報提取出來的光學系統,通過改變焦點的同時將所獲得的信息在圖像存儲器內復原,從而可以獲得具有3維信息情報的鮮明的圖像。通過這個方法,可以簡單地獲得以通常的顯微鏡所無法確認的、關于表面形狀的信息。另外,對于通常的光學顯微鏡來說,“提高分辨率”與“加深焦點深度”是相互矛盾的條件,尤其在高倍率時這個矛盾更為突出,但在共聚焦顯微鏡來講,這個難題迎刃而解。
1.共聚焦光學系統的優勢
共聚焦光學系統是對樣品進行點照明,同時反射光也采用點感受器來受光。樣品被放置在焦點位置時,反射光幾乎全部可以到達感光器,樣品偏離焦點時,反射光無法到達感光器。也就是說,共聚焦光學系統中,只有與焦點重合的圖象會被輸出,光斑、無用的散亂光都被屏蔽掉了。
2.為何用激光?
共聚焦光學系統中,對樣品進行點照明、同時反射光亦采用點感光器受光。因此,點光源就成為必要。激光屬于非常優秀的點光源。大多數情況下,共聚焦顯微鏡的光源都采用激光光源。另外,激光所具有的單色性、方向性以及優異的光束形狀等特征,也是被廣泛采用的重要理由。
3.高速掃描基礎上的實時觀察成為可能
激光的掃描,其水平方向采用了聲控光學偏向單元(Acoustic Optical Deflector,AO素子)、垂直方向采用了伺服電控光束掃描鏡(Servo Galvano-mirror)。音響光學偏向單元由于不存在機械性震動部分,所以可以進行高速的掃描, 在監視畫面上實時觀察成為可能。這種攝像的高速性,是直接影響聚焦、位置檢索速度的非常重要的項目。
4.焦點位置和亮度的關系
共聚焦光學系統中,樣品被正確地放置在焦點位置時亮度為,在它的前后,其亮度皆會銳減(圖4實線)。這種焦點面的敏感的選擇性,也正是共聚焦顯微鏡高度方向測定以及焦點深度擴張的原理所在。相對于此,通常的光學顯微鏡則在焦點位置前后不會有明顯的亮度變化(圖4點線)。
5.高對比度、高分辨率
通常的光學顯微鏡,由于偏離焦點部分的反射光會發生干擾,它與焦點成像部分發生重疊,從而造成圖像對比度的降低。而相對于此,共聚焦光學系統中,焦點以外的散亂光以及物鏡內部的散亂光幾乎被去除掉,因而可以獲得對比度非常高的圖像。另外,由于光線2次通過物鏡使得點像更加先銳化,也提高了顯微鏡的分辨能力。
6.光學局部化功能
共聚焦光學系統中,與焦點重合點以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在觀察立體樣品時,形成如同用焦點面對樣品進行切片后形成的圖象(圖5)。這種效果被稱為光學局部化,屬于共聚焦光學系統的特長之一。
7.焦點移動記憶機能
所謂焦點以外的反射光被微孔屏蔽掉,反過來看的話,可以認為共聚焦光學系統所成的像上所有的點均與焦點重合。因此將立體樣品沿Z軸(光軸)方向移動的話,將圖像累積保存在存儲器內,最終就會獲得樣品全體與焦點重合而形成的圖像。以這種方法將焦點深度無限加深的機能稱做移動記憶機能。
8.表面形狀測定機能
焦點移動機能上,追加以面的高度記錄回路,就可以對樣品的表面形狀進行非接觸式測定。以此機能為a基礎,對各畫素中輝度值形成的Z軸坐標的記錄成為可能,并以此情報為依據可以獲得樣品表面形狀相關的情報。
9.高精度微小尺寸測定機能
受光單元采用了1維CCD成像傳感器,因此可以不受掃描裝置掃描傾斜等的影響,從而可以完成高精度的測定。另外,由于同時采用焦點深度可調(加深)的焦點移動記憶機能,從而可以剔除由于焦點偏移而造成的測定誤差。
11.三維圖像解析
使用表面形狀測定機能,可以輕松地做出樣品表面三維圖像。不僅如此,還可以進行多種解析如:表面粗糙度測定、面積、體積、表面積、圓形度、半徑、長度、周長、重心、斷層圖像、FFT變換、線幅測定等等。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態,也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。