活性蛋白提取試劑盒使用操作說明
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For Research Use Only
一、 試劑盒說明
本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養細胞中提取具有活性的全蛋白， 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液
Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細胞，作用溫和，提取過程簡便。獲得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的測定的等后續研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 應用方面：可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性測定等后續研究.
二、試劑盒組份
組份 | KGP1050 50 tests | KGP10100 100 tests | 儲存溫度 |
Lysis Buffer | 50mL | 100mL | 2-8℃ |
磷酸酶抑制劑 | 500μL | 1000μL | -20℃ |
蛋白酶抑制劑 | 50μL | 100μL | |
PMSF（100mM） | 500μL | 1000μL | -20℃，避光 |
三、操作步驟
Ⅰ 實體組織蛋白的提取
1． 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑，1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF，混勻。冰上保存數分鐘待 用。
2． 每 100mg 固體組織置于培養皿中，剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊，加入 0.5～1 mL 冷 Lysis Buffer，玻 璃勻漿器上下手動勻漿 15 次，注意低溫操作；
3． 取組織勻漿液轉移到 1.5mL 預冷的離心管，離心 10000 轉/分，4℃離心 5 min；
4． 取上清轉移至新的預冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；
5． 分裝保存于-70℃,避免反復凍融。
Ⅱ 培養細胞蛋白提取
1． 貼壁培養的細胞，吸去培養基后，加入 10mL/150mm 培養板的冷 PBS 洗兩次，每次振搖數次以盡量去除培養液；
2． 懸浮培養的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞，將細胞及培養液移至離心管中，1000 轉/分離心 10 min，再用
10mL/150mm 培養板的冷 PBS，1000 轉/分離心 5 min 洗兩次；
3． 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑，1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF（用戶自配：濃度 100mM， 溶于異丙醇），混勻。冰上保存數分鐘待用。
4． 在上述培養板或離心管的細胞中，加入上述配制好的冷 Lysis Buffer，加入量如下表所示：
細胞數量 | Lysis Buffer 加入量 |
107 個 | 0.5 mL～1 mL |
5×106 個 | 0.2 mL～0.5 mL |
5．冷室或冰上操作，貼壁細胞用細胞刮子刮下，皆 Lysis Buffer 一同轉移至新的預冷的離心管中；懸浮培養或裂解
前刮下的貼壁細胞皆 Lysis Buffer 一同轉移至新的預冷的離心管中，
6．置于 4℃搖床平臺上，溫和振蕩 15 min；
7． 14,000rpm，4℃離心 15min，取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；
8． 分裝保存于-70℃,避免反復凍融。
四、注意事項
? 所有接觸樣品的用具及試劑均需預冷。
? 提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性劑
