PCR是基于DNA聚合反應原理的體外技術,它依賴于PCR儀,其包括反復加熱和冷卻反應的循環,用于使用熱穩定DNA聚合酶,引物序列和脫氧核糖核苷三磷酸進行DNA融化和酶的DNA復制。因此它可以將DNA的特定序列擴增多達十億次,大多數PCR方法可以擴增高達10千堿基對的DNA片段。以下是建立PCR反應所需的基本組件和試劑。
1、微量離心管是一個小圓柱形塑料錐形容器,錐形底部帶有卡帽,它們由聚丙烯制成,可以承受各種溫度。
2、PCR儀是一種用于擴增DNA片段的儀器,有一個帶孔的熱塊,可以插入容納PCR反應混合物的管子,循環儀的工作原理是珀耳帖效應,它通過反轉電流以預編程的方式升高和降低模塊的溫度,薄壁反應管允許有利的導熱性以允許快速熱平衡。
3、DNA模板,反應溶液應至少含有1e5到1e6目標分子。
4、引物,這些是定義待擴增序列的寡核苷酸,兩個引物與DNA靶的有義鏈和反義鏈各自的游離羥基末端互補,熔化溫度高于65攝氏度的底漆具有二次退火的趨勢。引物中GC含量應為40至60%。
5、 MgCl2是酶的輔助因子,優化鎂離子濃度是有益的,鎂離子影響引物退火,和PCR產物的鏈解離溫度,產物特異性,引物二聚體偽影的形成和酶活性和保真度,聚合酶需要結合的游離鎂。
6、KCl,KCl用于反應以促進引物退火。
7、明膠或牛血清,包括高壓滅菌的明膠或無核酸酶的牛血清白蛋白,以幫助穩定酶。
8、蒸餾水,使用高壓蒸餾的蒸餾水,體積取決于反應。
9、脫氧環核苷三磷酸,這些是DNA構建模塊,dNTP,dCTP,dATP和dGTP溶液中和至pH7.0。將初級儲備溶液稀釋至10mM,等分,并在零下20℃下儲存。推薦每種dNTP含有1mM的工作儲備液。在重復PCR循環期間,dNTP的穩定性使得在50個循環后約50%仍為dNTP。dNTP濃度在20和200微米之間對于反應是較佳的。
10、DNA聚合酶,它是一種催化反應的酶,從生長在溫泉中的水生棲熱菌中分離的TaqDNA聚合酶,在72攝氏度時表現較佳,90攝氏度的變性溫度不會破壞其酶活性。推薦濃度的Taq聚合酶為每100uL反應,然而酶活性將隨個體靶模板或引物而變化。 PCR反應建立在20到40個重復循環上,其中溫度在每個循環中變化。循環從高溫的單一溫度步驟開始,然后在末端保持一次以進行產品延伸或短暫儲存。
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