柱層析
（Column Chromatography）
一種常用的分離和純化混合物中不同成分的實驗技術。其基本原理是利用樣品中各成分在固定相和流動相之間的不同分配系數，實現分離，并得到目標
注意事項固定相在柱層析中，硅膠和氧化鋁是*常見的兩種固定相。硅膠一般是弱酸性的，而氧化鋁有堿性、中性和酸性的區別。對于酸穩定的物質分離，可以選用硅膠；在硅膠表面會分解的物質可以考慮使用氧化鋁。固定相的用量通常取決于以下幾個因素：● 樣品量：需要依據待分離樣品的量來確定硅膠的用量，一般建議固定相的量為樣品量的10–20倍。● 柱子的尺寸：柱子的直徑和高度會影響硅膠的用量。柱子越大，所需的固定相量也越多。硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了影響分離效果，太長了也會由于擴散或拖尾，從而影響分離效果。對于復雜的混合物，可能需要更多的固定相以提高分離效果。● 流動相的性質：不同的流動相也可能會影響硅膠的選擇和用量。● 對于烯烴、反式脂肪等難以分離的弱極性化合物，往固定相中加入銀鹽(AgNO3)，可以提高分離效果，有時甚至可以分離烯烴E，Z異構體。 流動相合適的流動相是保證*佳分離效果的關鍵。一般選擇流動相時需要考慮的幾個方面：● 極性：流動相的極性應與待分離成分的極性相匹配。通常，極性較大的成分應使用極性較強的溶劑，反之亦然。常用混合溶劑例如石油醚–乙酸乙酯、二氯甲烷–甲醇等作為流動相，極性可以通過二者比例進行調節。通過TLC薄層色譜可以進行流動相的初步篩選。一般而言，在TLC中保證分離目標物的Rf值為0.2–0.5的展開劑可作為合適的流動相。● 溶解性：盡量確保流動相能有效溶解待分離的成分，以便它們能夠順利通過柱子。● pH值：對于某些化合物，pH值會影響其離子化狀態，從而影響分離效果。選擇合適的pH值可以提高分離效率。例如，在硅膠柱層析胺類(生物堿)類物質、對酸敏感的縮醛(酮)類化合物時，可以在流動相中加入少量(0.1–1%)的三乙胺，可以減少硅膠柱對胺類物質的吸附損失，也可以避免敏感官能團的分解。● 洗脫順序：根據樣品中成分的極性和性質，選擇合適的洗脫順序，可能需要使用梯度洗脫（逐步改變流動相的極性）。特別是TLC顯示目標組分上方有小極性的雜質需要除去時，采用逐步加大流動相極性的梯度洗脫辦法可以顯著提高柱層析的效率。● 此外，流動相溶劑的粘度、揮發性、毒性等因素也需要進行考慮。 實驗步驟層析柱的填充● 準備柱子：確保柱子清潔干燥，完好無損。● 選擇固定相：根據實驗需要選擇合適的固定相，并準備好所需數量。● 填充柱子：將固定相緩慢倒入柱子中，確保固定相致密，避免產生空洞。（以干法為例）緩慢加入流動相，將固定相潤濕，此時可使用壓力球，并且確保柱子底部的流動相已足夠，避免產生氣泡。在填充過程中，也可定期輕輕敲擊柱子或使用真空抽氣裝置去除氣泡，確保固定相均勻分布。●平整表面：填充完成后，使用流動相輕輕沖洗頂部，以確保固定相表面平整。可加入少量石英砂于固定相表面，防止硅膠沖散。 *注意事項：● 避免過度壓實：填充時應避免固定相過度壓實，以免影響流動性和分離效果。● 保持均勻：確保固定相均勻分布，避免形成死區。● 控制流速：在填充和洗脫過程中，流速應適中，過快可能導致分離效果不佳。 樣品的準備（濕法上樣）● 準備樣品：將待分離的樣品溶解在少量的溶劑中，確保樣品溶解。● 將溶解好的樣品緩慢加入層析柱頂部，確保樣品均勻分布在固定相上。注意當濕法上樣體積較大時，樣品體積相對于色譜柱柱床的體積占比也會增大，擴散效應也會明顯增強，會導致峰寬變寬、分離效率和純度降低。● 可以用少量的相同溶劑沖洗樣品容器，以確保樣品轉移到層析柱中。● 開始洗脫：在樣品上方添加洗脫溶劑，開始洗脫過程，觀察分離效果。 洗脫操作通過壓力球對上方進行加壓，維持穩定的流速，可以加速洗脫過程。*后將*終得到的洗脫溶液進行TLC監測，可以判斷目標產物的出現。去除相關溶劑，就可得到較純的*終產物。在此過程中要注意以下幾點● 控制洗脫劑的流速：一般*佳的流速值是使得洗脫劑在柱子部分時候，液面降速為5 cm/min, 這就意味著直徑較小的柱子洗脫時流速比大直徑的要慢一些；● 洗脫過程中還應注意按照載樣量來確定每個fraction（通常用試管接收）的體積，避免出現前后組分交叉混合的現象。載樣越大，每個fraction體積也應該越多；● 洗脫中要盡量減少“加壓–減壓(放氣)”的次數，避免柱子內部出現“開裂”，影響分離效果；● 洗脫過程要密切關注液面位置，在柱層析結束前，要保證液面不低于沙子層。
