藥物引發的肝毒性問題是終止新藥研發和導致藥物退市最主要的因素之一，同時也是政府監管行為見的原因之一。如曲格列酮、非阿尿苷等均因嚴重肝毒性而被迫撤回。藥物引起肝損傷的發病機制主要有藥物直接損害、間接損害( 包括細胞毒性和膽汁淤積性) 、免疫介導性肝損傷、炎癥反應、線粒體失能以及機體對藥物的特異質反應。在相關發病機制中，我們對膽汁淤積性肝毒性知之甚少，其臨床前預測也于評估藥物抑制膽鹽輸出泵的能力，缺乏的評價標準。

1 藥品與試劑 

ASP，APAP，Nef，Tol，FA( 美國 Cayman 公司) ;Tro( 美國 ＲD 公司) ; Iso( 美國 Enzo 公司) ; 、、胎牛血清、Willams'Medium E 培養基( Gibco公司) ; 引物合成( Invitrogen 公司) ; TＲNzol 總 ＲNA提取試劑、DL2，000 DNA Marker ［TaKaＲa( 寶生物)公司］; 抗體( Abcam 公司) 。 

2 儀器 

ＲT-PCＲ 試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒( Qiagen公司) ; 96 孔板( 美國 Corning 公司) ; CO2 培養箱( 美國 ThemoForma 公司) ; CCK8 試劑盒( 日本同仁化學研究所) ; ( Abcom 公司) ; QL-902 渦旋振蕩儀( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司) ; Centrifuge 5415D 離 心 機 ( Eppendorf 公 司) ;NANODＲOP 2000 分光光度計( Therno Scientific 公司) ; Tanon 1600 凝膠成像系統( 上海天能科技有限公司) ; ABI7500 熒光定量 PCＲ 儀( Applied Biosystems 公 司) ; ELX 800 酶標 儀 ( 美 國 Bio-Tek 公司) ; HＲ220 掌上離心機( Servicebio 公司) ; Nikon Eclipse E100 正置熒光顯微鏡( 日本尼康公司) 。 

3 細胞 

HepG2 細胞( 本實驗室凍存) ; HepaＲG 細胞( 美國 Millipore 公司) 。4 2D 及 3D 細胞培養HepaＲG 和 HepG2 細胞接種于含 10% 胎牛血清，100 μmL － 1、100 μg·mL － 1、4 mmol·L － 1 L-的 Williams'Medium E 培養基中，于5% CO2 的 37 ℃ 恒溫培養箱中培養，達到 70% ～80% 融合時，吸棄培養基，PBS 清洗，加鏡下觀察細胞回縮變圓時終止消化，加少量培養基輕輕吹打制備細胞懸液，并傳代。3D 培養條件下，將 HepaＲG 分別以每孔 100，200，400，800，1 600 個接種于U 型底低吸附 96 孔板中，于 37 ℃，5% 的 CO2 培養箱中培養，形成3D 微球結構，可持續培養28 d，其間通過鏡下觀察球體變化并記錄其直徑大小。

通過優化實驗條件成功構建了 3D HepaＲG 肝毒性評價模型，能夠從一定程度上反映出該體外模型的優勢，也可以為膽汁淤積性肝損傷的研究提供一定的借鑒，但論據尚不充分，在接下來的研究中，將利用高內涵篩選技術檢測化合物對細胞活力、代謝凋亡及信號轉導等各個環節的影響，進一步探明引起藥物肝損傷的毒性機制，從而為化合物的安全性預測提供實驗依據。

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