real-time PCR
熒光定量PCR實驗步驟：
1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經過濕熱滅菌，無RNA酶）
1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預冷。
2）取100mg組織，加入到勻漿器中。
3）充分研磨直至無可見組織塊。
4）13000g離心10min取上清。
5）加入250 μl，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。
6）4℃下13000g離心8min。
7）將上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。
8）-20℃放置15min。
9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。
10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。
11）4℃下13000g離心5min。
12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3min。
13）加入20μl無RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃孵育5min。
2、反轉錄（槍頭和PCR均經過濕熱滅菌，無RNA酶）
1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl oligo(dT)15。
3）用無核糖核酸酶的去離子水補足至12μl。
4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉錄酶，用槍抽吸混勻。
6）于PCR儀上42℃保溫60min，結束后80℃保溫5min滅活反轉錄酶。
3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反轉錄產物 2.5μlddH2O 8.0μl2）取0.2ml PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM內參引物 2.0μl反轉錄產物 2.5μlddH2O 8.0μl3）PCR擴增預變性 95℃，10min循環（40次） 95℃，15s→60℃，60s溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃4、結果處理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)- CT(內標基因，待測樣本)B=CT(目的基因，對照樣本)- CT(內標基因，對照樣本)K=A-B表達倍數=2-K
real-time PCR
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