91154 化學成分限定的T細胞培養基使用說明

IrvineScientific公司以來遵守嚴格的cGMP/科研質量體系，IrvineScientific公司在細胞治療培養基領域對"Chemically Defined"和“Animal Component Free”有著嚴格的定義：

"Chemically Defined"化學成分限定：指培養基中的組分是無動物源的，不含任何動物蛋白或者人血蛋白，如BSA/HAS,而且濃度是明確的。

"Animal Component Free"無動物源成分 ：指不能有人或者動物來源的成分，并且只能使用植物或細菌產生的重組蛋白而不能使用來自動物或昆蟲細胞表達的蛋白。

     Irvine Scientific公司研發團隊開發了一系列的cGMP細胞治療培養基以支持細胞治療產業的應用，包括

- shou個無血清、無動物源、化學成分限定的T細胞培養基（貨號91154）

- shou個無血清、無動物源、化學成分限定的NK細胞培養基（貨號91215）

- 新一代無血清、無動物源、化學成分限定的DC培養基（貨號91146）

- 新一代無血清、化學成分限定的懸浮293細胞培養基（貨號91165）

- 無蛋白、無動物源、化學成分限定的細胞凍存液（貨號91139）

-無蛋白、無動物源、無DMSO、化學成分限定的細胞凍存液（貨號91140）

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91154 化學成分限定的T細胞培養基使用說明

存儲說明和穩定性

使用無菌技術處理以避免污染。 儲存在2-8oC，避光，直到準備使用。 該產品在原始包裝下在2-8oC下穩定，從1L PET瓶制造之日起14個月。 打開后，產品應在2-8oC的黑暗中儲存，并在4周內使用。 請勿在的到期日后使用。 未經驗證可在超過未開封的保質期內使用。

制備用于T細胞活化的平板

1. 用濃度為1μg/ mL的抗人CD3（克隆UCHT1）和抗人CD28（克隆CD28.2）抗體在37℃oC下涂覆2小時或在2-8℃下過夜oC用Parafilm®來防止蒸發。
2. 吸出涂層溶液。
3. 在加入細胞之前用PBS洗滌兩次。

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制備T細胞

1. 在使用前，在37oC下平衡足夠量的PRIME-XV T細胞CDM至少15分鐘。
2. 通過在37oC水浴中溫和攪拌小瓶1分鐘，解凍新鮮的冷凍保存的PBMC小瓶。
3. 小心地將小瓶的全部內容物轉移到含有預熱的10mL PRIME-XV T Cell CDM的15mL錐形管中。
4. 將細胞以200g旋轉10分鐘。
5. 小心吸出上清液，留下覆蓋細胞沉淀的小體積的培養基。
6. 補充PRIME-XV T細胞CDM，相當于200 U / mL（11,000 IU / mL）的IL-2。
7. 用補充的PRIME-XV T細胞CDM重懸細胞沉淀，并將細胞以100,000細胞/ mL的密度轉移到包被的平板上。
8. 將細胞在37℃oC和5％CO 孵育。
9. 每2至3天培養，用含有相當于200U / mL（11,000IU / mL）IL-2的PRIME-XV T細胞CDM進食。 飼料量應至少為原始培養體積的70％。

注意：應根據細胞密度和生長情況調整攝食事件和體積的頻率，以避免過度融合。

收獲T細胞

1. 使用細胞刮刀輕輕地從培養皿中取出T細胞。
2. 用溫度平衡的PRIME-XV T Cell CDM洗滌。
3. 細胞準備好進行分析，存儲或重新種植。

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G-Rex 6孔培養板中T細胞擴增的方案

第0天：T細胞的電鍍和活化

1. 在使用前，在37℃下平衡足夠量的PRIME-XV T Cell CDM至少15分鐘。注意：為避免溫度循環，請確定平衡前所需的總體積。
2. 將小瓶在37°C水浴中輕輕攪拌1分鐘，解凍一小瓶冷凍細胞。 或者，使用新鮮分離或收獲的細胞。
3. 小心地將小瓶的全部內容物轉移到含有10mL PRIME-XV T Cell CDM的15mL錐形管中。
4. 將細胞以200g旋轉10分鐘。
5. 小心吸出上清液，留下覆蓋細胞沉淀的小體積的培養基。
6. 補充適當體積的PRIME-XV T細胞CDM，相當于200 U / mL（11,000 IU / mL）的IL-2。
7. 將5×106PBMCs /孔置于35mL培養基中。
8. 添加以下可溶性激活抗體：

LEAF純化的抗人CD3濃度為10μg/ mL（克隆UCHT1）LEAF純化的抗人CD28濃度為5μg/ mL（克隆CD28.2）

1. 將細胞在37℃和5％CO2的培養箱中孵育。

第3天：繼續刺激

1. 以200 U / mL（11,000 IU / mL）添加額外的IL-2。

第7天：媒體交流

1. 通過從井的頂部邊緣緩慢移液，移除25mL廢介質，小心避免意外吸入細胞。
2. 輕輕旋轉或重新懸浮剩余的液體，使細胞均勻分散細胞計數。
3. 加入30 mL新鮮培養基補充劑，IL-2，200 U / mL（11,000 IU / mL）。

第10天：繼續刺激

1. 以200 U / mL（11,000 IU / mL）添加額外的IL-2。第14天：收獲細胞
2. 通過從井的頂部邊緣緩慢移液，移除25mL廢介質，小心避免意外吸入細胞。
3. 輕輕旋轉或重新懸浮剩余的液體，使細胞均勻分散細胞計數。
4. 以剩余體積收獲細胞。

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